Review of microsphere optical microscopy for super-resolution imaging and metrology
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摘要: 受衍射极限的影响，传统光学显微镜的分辨率最高约为波长的一半，突破衍射极限，获得更高的成像分辨率是近年来显微成像领域的研究热点。相比于其他超分辨显微成像方式，基于微球透镜的超分辨显微成像方式具有简单直接、免标记等优点。主要介绍国内外研究团队将微球与传统的光学显微镜结合实现超分辨显微成像的研究进展，从微球透镜参数选择、成像方案、成像分辨率、成像视场及成像机理等多角度进行总结与比对；并结合课题组工作，介绍了将微球透镜与干涉显微技术相结合的三维超分辨检测技术，阐述了Linnik型与Mirau型两种检测光路原理，分析了三维超分辨检测的效果；展望了微球透镜超分辨显微技术在显微成像与显微干涉检测两个方面待解决的问题与发展方向。Abstract: Due to the diffraction limit, the greatest resolution of conventional optical microscopes is about half of the wavelength. Efforts to overcome the diffraction limit and to obtain higher imaging resolution have been hot researching spots of optical microscopy imaging field in recent years.Compared with other types of super-resolution microscopy imaging, the method based on microsphere optical microscopy is characterized by simple direct and label-free, etc. This paper briefly introduces the research progress of super-resolution microscopy imaging is, which combines microsphere with conventional optical microscopes by domestic and foreign teams, summarizes and compares from multiple aspects of microsphere lens parameters, imaging scheme, resolution, field and mechanism. Further, this paper elaborates the three-dimensional super-resolution metrology by combining microsphere lens with interference microscopy, is d as well as our research team work, described the optical paths in the types of Linnik and Mirau are, and analyzes the super-resolution measuring results are. Finally, it discusses the applications of the microsphere lens for super-resolution in microscopy imaging and interference metrology, and some of the future research works are prospected.
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引言
照明系统对于机器视觉系统[1]中图像的获取起着关键性的作用，发光二极管（light-emitting diode, LED）由于具有寿命长、成本低、效率高和可控性等优点[2]，目前已经成为第四代新光源[3]，被人们广泛应用到机器视觉照明[4]和道路照明中，光源的光照效果与能量利用率[5]也成为人们关注的热点。LED光源属于朗伯光源[6]，其发光光束角2θ1/2为120°，由于发光角度过大，光束汇聚率较低[7]，从而导致光束相应照射接收面上的光照均匀度[8]与能量利用率较低[9]。针对此类问题，夏勋力等人提出了一种LED朗伯光源光型模型封装方法[10]；王海洋等人研究了反光杯对于LED光源光束准直的特点[11]；樊冬新等人采用拓展光源的发光二极管反光杯实现能量的重新分配[12]。在目前的二次光学设计中，光学系统主要分为由透镜[13]或反光杯[14]构成的两种主要系统模型[15]。透镜[16]作为主要的配光元件[17]，已经进行了大量的研究和展示，但使用效果并不太理想。相比于透镜来说，反光杯的光源消耗更少、成本更低、加工方便，因此，采用反光杯结构实现照明更方便、高效[18-19]。
目前针对LED光源系统[20]的设计，大部分研究都是运用斯派罗法则分析[21]与和微分方程计算[22]的方法优化，再通过研究光照分析图得到最优实验光照结果，这些方法普遍存在优化层面单一、周期长和误差较大等问题。针对这些问题，本文将设置特定的评价函数指标，运用数值分析原理将光源优化问题转换为评价函数量化问题，将快速、准确、高效地实现二次光学器件光照均匀度与能量利用率的同步优化。
论文首先对单个LED光源系统进行优化设计，同时考虑在实际照明应用中，单颗LED光源的光照强度不能满足实际应用要求，进一步对双光源系统进行优化设计。实验结果表明，在多光源系统中，光源间排列的间隔严重影响了接收面上光斑均匀度与光源能量利用率，通过设置评价函数对间距进行优化，最终在接收面实现了多LED光源照明系统的高照均匀度和高能量利用率。
1 光学透镜设计理论分析
LED光学照明系统主要采用反光杯与透镜两种方式。反光杯主要对光束起反射效果，通常应用于准直光束或聚光照明等，如照明手电、无影灯、望远镜等。反光杯发射出的光照能量，能够对接收面上的均匀照度区域进行补偿，最终形成光照度均匀的光斑分布。同时反光杯具有较高的能量利用率，能够将LED芯片发射出来的光束尽可能地汇聚于接收面上。
反光杯内部的光束存在反射和直射两种情况，直射的光束直接照射到接收面形成部分光斑，但此时的照度光斑并不均匀，需要经过反光杯第二面反射光束的补偿，才能形成光照均匀的光斑。因此，本文通过调节反光杯第二面的圆锥常数K与曲率半径R对反光杯进行优化建模，在照明接收面获取高光照均匀度和高能量利用率。图1为反光杯示意图。反光杯抛物线方程可表示为[23]
$$ H=a{\phi }^{2}/4+c $$ (1) 式中：$a = (2H+\sqrt{4{H}^{2}+{\phi }^{2}})/{\phi }^{2}$；$c = (2H- \sqrt{4{H}^{2}+{\phi }^{2}})/4$；$\phi$和$ H $分别为反光杯的口径和高度。光源芯片位于坐标原点处，由光源发出的光线通过反光杯的第二面参数来决定反射光线的数量与其在接收面上的补偿效果。
反光杯通过其第二面曲面对内部放置光源发射出的光束进行反射汇聚，在不同的二次曲面下（K值不同），对于光源光束的作用效果大为不同。当圆锥常数K=0时,轨迹表示为点；当0<K<1时，表示为椭圆曲线；当K=1时，表示为抛物线曲线；当K>1时，表示为双曲线。相对于其他二次曲面，抛物面的汇聚能力比较强。因此，本文假设反光杯第二面曲面为抛物面，即K=−1。同时，当反光杯第二面为抛物面时，光源应放在此抛物面的焦点处，这样才能使光源的能量利用率较高。由于抛物面的曲率半径R是焦距f的2倍[24]，即：
$$ R=2f $$ (2) 因此，可以通过抛物面半径R快速计算出抛物面焦距f。本文设定光照度评价函数和能量利用率评价函数对优化的光学系统效果进行更精确的评价。具体评价函数表示如下：
光照均匀度评价函数：光照均匀度=最大光照度值/平均光照度值（Uniformity = Maximum / Average）；能量利用率评价函数：能量利用率=总光通量/发射光通量(the-tput为接收面上能量利用率的值)；综合评价函数：综合评价函数值=（1−能量利用率）+光照均匀度(the-merit-function = (1− the-tput ) + Uniformity)。
当光源光线经反光杯传输时，光照均匀度评价函数值越接近1，其接收面上光照均匀度越高，与理想均匀度越接近；当光线从光源发出后，到达接收面上的光线数量越多，其能量利用率越高，能量利用率评价函数值越大；综合评价函数用于同时评估光照均匀度与能量利用率，当输出均匀度和损耗光能效率之和最小时，此时综合评价函数值最小，得出此时光照均匀度与能量利用率达到最优状态。设定的评价函数适用于单光源反光杯的优化与多光源下的间距优化。在进行优化设计时，采用Cree公司XLamp XP-E LED系列的White5000-10000K，用一块半径和厚度分别为35 mm、1 mm的圆形几何体来模拟LED发光芯片。光线追迹数量选取为500 000条，建立的反光杯模型厚度为1 mm，内壁设置为perfect mirror，是一个理想的反光镜。
2 设计与仿真
2.1 光源建模
对于照明系统而言，照明目标的光照均匀度、亮度大小、能量利用率及生产成本等因素是设计时必须考虑的，同时光照范围也是体现一个照明系统最为重要的一个环节。在反光杯光源系统中，光照范围S与反光杯的高度H和出射角θ存在一定的关系[25]，即：
$$ R=H\mathrm{t}\mathrm{a}\mathrm{n}\theta $$ (3) 在反光杯高度不变的前提下，可以通过改变θ角来控制接收面范围R的大小。然而，由于LED的空间光强是满足近似的朗伯分布，这部分光线在照明接收面上形成了照度随出射角θ增加而逐渐降低的分布。因此，如果要在接收面照明范围内获得均匀分布的照度，可以通过调整反光杯反射部分的光，对接收面直射部分的光进行补偿。对此，我们将采用通过改变反光杯的形状，对LED光源发出的光线进行定向优化设计处理，即优化设计反光杯第二面圆锥常数K和曲率半径R，达到需要的效果。
光源系统仿真模拟图如图2所示。当单个LED照明光源距离照明接收面超过一定范围时，可采用单独发光芯片取代整个光照元器件发光，在整个光学照明系统进行光线追迹过程中，并不会对结果产生影响。
2.2 单光源系统的优化设计
在仿真过程中，对于光源的摆放位置，反光杯第一面不改变光路，因此第一面的二次曲面常数和曲率半径一般设定为0，即K=R=0。反光杯的第二面会对光线进行反射汇聚，对接收面的中心光斑进行均匀性补充。假设反光杯的二次曲面系数K=−1，即反光杯为抛物面，曲率半径R=33 mm。设置接收面为半径1700 mm、厚度1 mm的圆形几何体，与光源距离Z=3 000 mm。通过采用Monte Carlo算法的离散分布光线追迹技术原理进行模拟实验的搭建，基于能量利用率评价函数和光照均匀度特定评价函数的数值分析计算得到能量利用率为83.25 %，光照均匀度为3.29。优化前的仿真模型图如图3所示。光线由光源芯片发出，经反光杯反射传播，到达接收面上。优化前接收面获得的照度图和坎德拉光强图如图4所示。
由图4可知，LED光源发射的大部分光线都汇聚在接收面中心部分区域，造成接收面中心与四周的光照强度差距较大，产生较差的视觉感受。通过我们设定的特定评价函数计算得出光照均匀度评价函数值为3.29，远大于照明均匀度理想值1。此时照明均匀度与理想值的接近度为1/3.29≈30.4 %。在此基础上，若要提高照明均匀度，则需结合特定评价函数指标进行数值量化分析。以反光杯二次曲面常数K和曲率半径R为变量，在2个变量同时改变的情况下，计算出光照均匀度和能量利用率均为最优 。
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图 4 优化前接收面获得的照度图和光强图Figure 4. Illumination diagram and light intensity diagram obtained from receiving surface before optimization在初始优化取值时，通常情况下二次曲面常数K取−1，曲率半径R取33 mm。因此在优化过程中，在二次曲面常数K为−0.9～−1.1，曲率半径R为32 mm～34 mm范围内进行优化仿真，判断在此范围内接收面上照度均匀度和能量利用率为最优解时的K值与R值。
优化数据统计表见表1所示。表1展示了二次曲面常数K和曲率半径R取不同值时，得到的接收面光照均匀度评价函数值（Uniformity）、能量利用率评价函数值（tput）和综合评价函数值（the-merit-function）等。通过设定特定评价函数为主要分析依据，在一定范围内以反光杯二次曲面常数K和曲率半径R为具体变量进行数值优化分析，可同时得到最优的光照均匀度和能量利用率。此时光照均匀度评价函数值Uniformity = 2.24，与理想值的接近度为44.6%，与优化前相比均匀度提高14.2%，能量利用率提升了16.75%。优化后接收面获得的照度图和坎德拉光强图如图5所示。
表 1 优化数据统计表Table 1. Optimization data statistics综合评价
函数值光照均匀度
评价函数值能量利用率
评价函数值曲率半径/mm 圆锥常数 最优曲率
半径/mm最优圆锥常数 最优综合
评价函数值2.240 9 2.240 9 1 32 −0.9 32 −0.9 2.240 9 3.153 9 3.050 8 0.8968 32 −0.966 7 32 −0.9 2.240 9 3.562 7 3.370 3 0.8076 32 −1.033 3 32 −0.9 2.240 9 3.865 2 3.607 2 0.7419 32 −1.1 32 −0.9 2.240 9 2.270 2 2.268 3 0.9980 32.666 7 −0.9 32 −0.9 2.240 9 3.180 8 3.066 3 0.8854 32.666 7 −0.966 7 32 −0.9 2.240 9 3.613 7 3.411 7 0.7979 32.666 7 −1.033 3 32 −0.9 2.240 9 3.906 0 3.640 2 0.7341 32.666 7 −1.1 32 −0.9 2.240 9 2.322 3 2.313 1 0.9908 33.333 3 −0.9 32 −0.9 2.240 9 3.200 8 3.074 6 0.8739 33.333 3 −0.966 7 32 −0.9 2.240 9 3.652 6 3.441 1 0.7885 33.333 3 −1.033 3 32 −0.9 2.240 9 3.927 2 3.653 4 0.7262 33.333 3 −1.1 32 −0.9 2.240 9 2.383 8 2.363 6 0.9798 34 −0.9 32 −0.9 2.240 9 3.246 3 3.109 1 0.8627 34 −0.966 7 32 −0.9 2.240 9 3.673 8 3.453 2 0.7795 34 −1.033 3 32 −0.9 2.240 9 3.924 8 3.643 3 0.7184 34 −1.1 32 −0.9 2.240 9 ![]()
图 5 优化后接收面获得的照度图和光强图Figure 5. Illumination diagram and light intensity diagram obtained from receiving surface after optimization2.3 双光源系统的优化设计
由于在实际场景运用中，单颗LED光源的功率较低，发射光亮度较低，不能满足实际场景的使用要求，因此需要多颗LED光源进行阵列排布，形成大功率的集成光源，以满足所需要的照明效果。但是，2个及2个以上的LED光源在排列分布时，往往由于间距把握不好，导致光照均匀度较低或能量利用率不足。因此，本文进一步对双光源系统进行了优化设计。根据单光源系统的优化结果，反光杯第一面K=R=0，第二面K=−0.9、R=32 mm。2个光源初始间距为1 mm，优化的间距范围lgap取1 mm～1 500 mm。以50 mm作为间隔进行自动优化，由系统自动计算出接收面在每个间隔下的光照均匀度和能量利用率，并进行数据对比，优化出较高光照均匀度和能量利用率的光源间隔。双光源间距优化仿真图如图6所示。
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图 6 双光源间距优化仿真图Figure 6. Simulation diagram of spacing optimization of dual-light sources图7为光源间距优化图。图7显示了双光源在不同间距下光照均匀度评价函数和能量利用率评价函数的大小。从图7可以看出，当光源以间距lgap = 1 050 mm进行分布排列时，可实现最优的光照均匀度和能量利用率，光照均匀度Uniformity = 2.23，与理想值的接近度为44.84 %，能量利用率Rtput = 88.84 %。
2.4 阵列式光源系统设计
根据在单光源系统优化和双光源系统优化基础上获得的最优参数，构建出同时获得最优光照均匀度和能量利用率的阵列式光源系统。选取矩型阵列式光源系统为测试对象，构建一个3×3的矩形阵列式光源系统。根据单光源系统和双光源系统的优化结果，反光杯第一面K=R=0，第二面K=−0.9、R=32 mm，光源之间间隔lgsp=1 050 mm。由系统计算出在此最优参数基础上接收面的光照均匀度和能量利用率。矩形阵列式光源系统仿真图如图8所示。
图9为矩形阵列式光源系统接收面获得的照度图和光照强度图。从图9可以看出，通过优化，矩形阵列式光源系统获得了良好的光照均匀度和能量利用率，接收面照明区域的照度曲线居高且平稳，其中光照均匀度Uniformity = 2.88，与理想值的接近度为34.72%，能量利用率Rtput = 90.64%。整体阵列光源系统的光学性能在一定程度上均达到较好的效果。
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图 9 矩形阵列式光源系统接收面获得的照度图和光强图Figure 9. Illumination diagram and light intensity diagram obtained from receiving surface of rectangular array light source system3 结论
本文通过设定相应综合评价函数，运用数值分析方法，将光源系统的优化问题转变为评价函数的量化问题，实现光源系统在光照均匀度和能量利用率等方面的同步优化。利用设定光照均匀度评价函数、能量利用率评价函数和综合评价函数等相关特定函数计算光照均匀性和能量利用率，运用数值分析方法对反光杯第二面圆锥常数和曲率半径进行优化调整，实现了单光源反光杯系统的较高照明均匀性和能量利用率。将所优化的光学系统进行仿真验证，并将优化完成的光学系统与传统方式的优化系统进行比较，结果表明，光照均匀度提高了14.2%，与理想值的接近度提高了14.42%，能量利用率提高了16.75%，证明了特定评价函数优化方法的可行性、准确性和高效性。同时将此优化方法运用到多光源系统，以特定评价函数为基础，光源间距为主要变量，优化得出多光源系统的光照均匀度为 2.23，与理想值的接近度为44.84%，能量利用率为 88.84%。证明了特定评价函数优化方法在不同条件下的有效性，可以针对性地对单光源系统和多光源系统进行效果优化，提高了光源系统的性能。最后，在优化完成光源系统并得出最优相关参数的基础上，构建出矩形阵列式光源系统，进一步证明了特定评价函数在阵列式光源系统中的优化可行性，使大功率阵列式光源在光照均匀度和能量利用率方面得以优化提升，显著提升了大功率阵列式光源系统的整体性能效果。
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图 6 钛酸钡微球浸没在PDMS薄膜中的成像方案
Figure 6. Imaging scheme under barium titanate microsphere immersion in PDMS film
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图 7 微球PDMS膜完全浸没下观察的蓝光光盘成像结果
Figure 7. Blue disc imaging resultsunder complete immersion of microsphere PDMS film
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图 9 二氧化硅微球直径与成像放大倍率之间的关系
Figure 9. Relationship between diameter of silicon dioxide microsphere and magnification of imaging
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图 10 钛酸钡微球直径与放大倍率之间的关系
Figure 10. Relationship between diameter of barium titanate microsphere and magnificationof imaging
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图 11 成像视场与微球直径之间的关系
Figure 11. Relationship between imaging field of view and microsphere diameter
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图 17 100 μm BaTiO3微球浸没在3种介质中的汇聚情况
Figure 17. 100 μm BaTiO3 microsphere immersion in aggregation of three mediums
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图 18 干涉显微光路图以及蓝光光盘三维恢复结果
Figure 18. Interference microscopicoptical path diagram and blue-ray disc 3D recovery results
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图 20 二氧化硅微球结合50倍干涉物镜获得的DVD光盘高度信息
Figure 20. DVD height information obtained by silicon dioxide microsphere combined with 50 times interference objective
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图 22 微球结合干涉物镜获得的光盘表面结构干涉图
Figure 22. Disc surface structure interference diagram obtained by microsphere combined with interference objective
表 1 不同成像方案下的结果
Table 1 Results under different imaging scenarios
课题组 物镜 微球 样品 分辨率/nm 倍率 数值孔径 折射率 直径/μm 浸没情况 王增波[7] 80 0.9 1.46 2~9 无浸液 AAO样品 50 (λ/8~λ/14) A. Darafsheh[9] 20 0.4 2.1 53 浸没(异丙醇) 蓝光光盘 100 Seoungjun Lee[10] 50 0.75 1.59 50 无浸液 蓝光光盘 100 Lin Li[11] 50 0.75 1.9 100 浸没(水) AAO样品 50 (λ/8~λ/14) 50 0.75 1.9 100 浸没(水) 蓝光光盘 100 A. Darafsheh[12] 20 0.4 1.51 53 无浸液 蓝光光盘 100 20 0.4 1.9 10 浸没(异丙醇) 纳米柱 60 (λ/7) 100 0.9 1.9 65 PDMS浸没 蓝光光盘 100 Hok Sum Sam Lai[15] 100 0.9 1.9 200 无浸液 间距40 nm的CPU 40 
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表 2 不同浸没液折射率下的放大倍率
Table 2 Magnification of different immersed fluid refractive indicators
n=1.33 n=1.38 n=1.548 SiO2 1.8 1.67 1.44 BaTiO3 3.96 2.88 2.11
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表 3 二氧化硅微球在不同直径、样品、物镜、浸没方式下对应的放大倍率
Table 3 Corresponding magnification of silicon dioxide microspheres in different diameters, samples, objective lens, immersion modes
课题组 物镜 微球 样品 放大倍率 倍率 数值孔径 折射率 直径/μm 浸没情况 王增波[7] 80 0.9 1.46 4.74 无 宽360 nm，间隔130 nm的光栅 4.17 80 0.9 1.46 4.74 无 AAO孔，直径50 nm，间隔50 nm 8 刘旭[8] 100 0.8 1.46 3 无 蓝光光盘，宽200 nm，间隔100 nm 2.7 100 0.8 1.46 3 乙醇半浸没 蓝光光盘，宽200 nm，间隔100 nm 2 叶永红[14] 100 0.9 1.46 1.97 无 直径280 nm的PS小球阵列 2 100 0.9 1.46 1.97 无 直径415 nm的PS小球阵列 3.42 100 0.9 1.46 3.35 无 直径280 nm的PS小球阵列 1.95 100 0.9 1.46 3.35 无 直径415 nm的PS小球阵列 3.34
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